咱们聊聊细胞培养这块儿，好多头疼事吧？第一号问题就是细胞不贴壁，就得先找病根。胰酶用多了，细胞都给伤着了，那就缩短时间或者把浓度降降。要是有支原体捣乱，必须赶紧检测，阳性的直接扔掉别留着。 还有培养箱不干净，支架也得擦擦，再拿紫外灯多晒晒，把这些微生物都赶走，给贴壁因子腾地方。 接着说培养液的pH值老是跳来跳去，像坐过山车一样。这问题多半是CO₂张力不对、瓶盖没拧紧、NaHCO₃加多了、盐配方出了岔子，或者有微生物在那边产生副产物。 先按公式算一下，2.0 g/L的NaHCO₃对应5%的CO₂。调好后再稍微微调一下，把空气和CO₂调成95%和5%。不想总依赖CO₂的话，干脆换成HEPES缓冲型的培养液，瓶盖松一圈就行了。 要是真的被污染了，要么扔掉瓶子重新弄，要么用抗生素洗洗。否则细菌发酵起来，pH值能一夜掉到零。 细胞原本长得挺快，突然就慢下来了，这是进入了节能模式。原因很多，可能是换了新培养液、血清批次不同、试剂没保存好、谷氨酰胺用光了或者是生长因子不够了。 咱们得把新旧成分一项项对比看看，最好用以前用的血清做个对照实验。找出差异后再动手：把接种的密度提上来，再给谷氨酰胺或者生长因子补点进去，这样24小时就能看到细胞密度回升了。 如果污染不严重，可以先不用抗生素培养3天，看看情况再决定要不要用抗生素来救急。 第四号问题就是细胞大量死亡。这事儿多半是CO₂没了、温度不稳、冻存复苏时受了伤、渗透压飘了、还是有毒的代谢物堆积太多了。 先检查一下培养箱的读数：温度要在±1 ℃内波动，CO₂别超过±0.2 %。再测一下渗透压是不是在260到350 mOsm/kg之间。要是复苏后死了一大片，最划算的就是重新拿点冻存的种子来复苏。 第五个是显微镜下的黑胶虫问题。这些黑点点不是细菌，是细胞应激后释放出来的微颗粒。接种密度太低、状态不好、血清质量差的时候最容易看见它们。 换品质更好的血清试试吧；或者加点滋养细胞（比如小鼠腹腔巨噬细胞）让它们当清道夫。换液之前先拍一拍瓶子壁子，用生理盐水冲一冲坚持个七天左右黑点就会少一半。 还有更高级一点的办法：把环丙沙星和哌拉西林各10 μg/ml碾碎配成母液过滤后放冰箱里存着。每三天加一次坚持两周下来黑胶虫数量就会肉眼可见地变少了。 最后说说支原体感染的事吧。一旦中招了细胞形态会变：从梭形变成圆形再飘起来；显微镜下看细胞膜上有密密麻麻的圆点；消化的时候这些圆点会掉下来还会导致培养液变碱起泡。 标准操作就是用试剂盒再加上PCR确认一下阳性就得赶紧全扔掉别再浪费时间和钱了。