小室重复利用。把用完的小室膜清洗干净就给你了。要把棉签刮掉基质胶，再用胰酶泡一会儿。 接着用75%酒精冲洗一下，然后用低超声处理30分钟，最后用水冲3次，每次5分钟，再用蒸馏水冲3次。晾干之后就可以给小室膜正反面分别照30分钟紫外灯，放到细胞培养台上就能再用。如果想要更彻底的杀菌除味效果，还可以把膜反面向下单独拿出来，正面给照3小时，反面照6小时，最后用低火微波加热10分钟两次就行了。 上层培养液要用无血清培养基。把渗透压平衡好，细胞在上层就不会自己吃饱喝足了。 还可以添加0.05%到0.2%的BSA或0.5%到1%的FBS，让细胞饿不到又不会渴死。 实验前先把MMPs测一下，比如MMP-2和MMP-9等关键酶的活性。这样就不用盲目去做实验了。 细胞饿着点更好。给它撤血清饥饿12到24小时，把基线降到最低。 基质胶可以用Matrigel包被再水化。把Matrigel按1:8稀释一下铺在小室上室面，4℃晾干成胶。 要是要铺FN的话，就在下室用剪掉尖端的枪头划S形涂匀。胶原就更简单了，直接用0.5mg/ml浓度的胶涂在底部晾干就好。 把吸水后的板里残液吸掉，每孔加50微升含10克/升BSA的无血清培养液静置30分钟，让基质胶充分水化。 也可以偷懒一点：先在上室膜中央加60到80微升稀释后的Matrigel，浸湿膜为止后再静置30分钟成胶。 准备工作做好了就把小室嵌回培养板里加300微升预温无血清培养基“润膜”15到30分钟，吸走多余液体等着细胞开吃。 细胞悬液要注意密度和血清的搭配。可以提前去血清饥饿一下或者直接用PBS洗1到2遍重悬。 调整密度到1到10×10^5/ml之间比较好。 接种细胞的时候不能有气泡出现。取200微升细胞悬液加到上室里。 再给下室加500微升含FBS或趋化因子的培养基就好。 抬头看看有没有气泡出来，如果有的话赶紧提起小室再放下几次直到看不到气泡为止。 培养时间选12到48小时比较合适。癌细胞侵袭力强的话就可以取上限时间。 但是千万别超过72小时哦！因为时间太长会让MMPs释放到培养液里面导致活性掉下来。 固定和染色的时候要注意让膜风干一下。 用棉签轻轻擦去基质胶和上室里的细胞，这样才能让染料附着在膜上看到信号。 染色之后用清水冲掉浮色倒置显微镜拍照底朝上就能看清穿膜细胞了。 计数的时候至少要取4个互不重叠的视野平均一下才是最终结果。 记得做三组平行孔RSD小于10%才算靠谱数据。 如果条件允许的话还可以设0小时、12小时、24小时和48小时四个时间点用GraphPad软件做时间依赖曲线。 这样会让审稿老师更认可你的实验结果哦！