Alexa Fluor、BSA、CD44、DAPI、DN、DNA、DNase、FITC、FITC-dUTP、Fluor、GFAP、IF、IF-TUNEL、NeuN、PBS这些关键词必须保留。IF-TUNEL双染技术，简单说就是在一个显微镜视野下，给凋亡的细胞打上绿色的“死亡标签”，同时用红色荧光标记特定的蛋白或者细胞类型，最后用蓝色的DAPI把细胞核固定下来。三种颜色合在一起，就能解答“哪类细胞在凋亡，它又表达什么蛋白”的关键问题。 选择样本类型和荧光组合很重要。细胞爬片和冰冻切片是比较方便的选择，抗原保存也比较好。石蜡切片虽然步骤多，背景容易高，但是能保存很久。做荧光通道的时候要注意顺序：先做TUNEL再做IF。高温高压修复代替蛋白酶K，在抗体之前进行TdT酶反应，这样能避免抗体堵住DNA缺口，减少后续荧光串色。推荐的组合是：TUNEL用FITC-dUTP或者Alexa Fluor 488，IF用Alexa Fluor 555或者647，核染用DAPI 405 nm。 标准流程大致分为六步，每个步骤都有容易出错的地方。样本制备和固定：细胞爬片用4%多聚甲醛室温固定15-30分钟，然后用PBS洗三次；冰冻切片室温复温5分钟，再用4%多聚甲醛固定10-15分钟；石蜡切片需要脱蜡、梯度复水、柠檬酸盐缓冲液抗原修复10分钟。通透与封闭：用0.1%-0.2% Triton X-100/PBS通透10分钟；用3% BSA/PBS封闭30分钟来降低非特异性背景。TUNEL反应：平衡缓冲液室温10分钟后，按试剂盒配反应液37℃湿盒避光60-120分钟；细胞通常60分钟就够了，组织可以延长时间；最后用PBS洗三次终止反应。免疫荧光（IF）：一抗用1% BSA/PBS稀释后4℃湿盒过夜；荧光二抗如Alexa Fluor 555室温避光50-60分钟；再用PBS洗干净。核复染与封片：DAPI染核5分钟后PBS洗干净；用抗荧光淬灭封片液封片并避光保存。观察与成像：分别采集绿色、红色、蓝色通道图像合并起来；共定位判定就是绿色+红色+蓝色重叠的地方就是目标蛋白阳性的凋亡细胞。 有几个地方特别容易出错需要注意：一定要先做TUNEL后做IF；荧光组合要选光谱分开的；通透和酶消化要匹配；还有就是阴性对照和阳性对照都不能少。应用场景也很多：肿瘤研究可以看看肿瘤细胞凋亡加上Ki67/CD44这些增殖干性标志物；神经科学可以研究神经元凋亡加上NeuN/GFAP双染；药物筛选可以用药物诱导凋亡加上线粒体膜电位或者caspase级联蛋白验证；发育生物学可以追踪胚胎特定细胞群凋亡动态。总之把这个技术装进科研“大炮”里就能发挥大作用了。