uncle 破解蛋白稳定性，uncle 平台简直就是个宝库

从这9个字段来破解蛋白稳定性，Uncle平台简直就是个宝库。当药物开发进入优化阶段，用热变性结合荧光检测差不多是最流行的做法，虽然内源荧光看着挺直观，但要是碰到没芳香族氨基酸的复杂蛋白，或者需要高灵敏度的时候，染料或标记技术就得派上用场。Uncle把全光谱荧光、静态光散射SLS、动态光散射DLS都放进了一个密封池子里，只要加9微升样品，就能一次拿到荧光、聚集程度、粒径大小和多分散性这些数据，再也不怕漏看什么了。拿多克隆牛IgG做例子，把5000倍的SYPRO Orange稀释到400倍后，溶解在2.2毫克每毫升的PBS里就挺平稳。当温度从15度升到67度时，染料荧光在590纳米处一下就飙高了，把疏水区域都点亮了；而内源荧光的变化则是在300到430纳米之间重心偏移。两条曲线走势一样但时间点错开，彼此没干扰。软件是怎么分的呢？Uncle用重心平均法BCM把内源荧光拆开算成纯蛋白质的信号，再用外源染料的面积变化做参考。结果发现有无染料的情况下算出来的Tm只差0.3度，说明SYPRO Orange没打乱去折叠的平衡；同时SLS曲线显示它还能挡住新暴露的疏水区域延缓小聚集体形成。 RNase A这个只有124个氨基酸且没有色氨酸的酶以前研究起来挺麻烦，Uncle给它配上ANS后情况大不一样。ANS钻进疏水口袋后发射峰从545纳米蓝移到470纳米，信号跟着去折叠像台阶一样往上走。用BCM在400到630纳米扫描发现Tm值会随着磷酸盐浓度升高往右移和文献对上了号。 BLG虽然带游离半胱氨酸但老被表面活性剂影响，Uncle选了个专门针对巯基的CPM染料在65度时抓它去折叠的瞬间。全光谱看下来CPM在400到650纳米激增而内源荧光因为被CPM的吸收带挡住变成了拖尾形状证明结合上了。内外夹击下算出来Tm大约60度跟文献值一样准。 Uncle把这些技术都装进一个系统里做一次实验就能出Tm、Tagg这些关键指标。不管蛋白弱不弱有没有芳香族氨基酸或是膜蛋白亲脂性蛋白只要能用266或473纳米激光激发都能给你看个透彻全面快速还能高通量开发早期就能把稳定性搞清楚改好。